Invitrogen脂質(zhì)體2000的操作流程及注意事項(xiàng)

Invitrogen脂質(zhì)體2000的操作流程及注意事項(xiàng)

*，Invitrogen脂質(zhì)體2000是廣大老師所熟知的轉(zhuǎn)染試劑，其特點(diǎn)：轉(zhuǎn)染步驟快速簡(jiǎn)便

（1）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，有血清也不怕。

（2）轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofectamine 2000試劑，無需換培養(yǎng)基。

我們介紹一下 Invitrogen脂質(zhì)體2000的操作流程、注意事項(xiàng)等。

一、操作流程   
事實(shí)上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡(jiǎn)單：稀釋DNA以及Lipofectamine 2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育24－96小時(shí)檢測(cè)結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細(xì)流程和注意事項(xiàng)。
1、轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在0.5ml                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
2、對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.8μg-1.0μg DNA。3、對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)降低活性。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細(xì)胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為L(zhǎng)ipofectamine 2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。
4、混合稀釋的DNA（第2步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。 注意：溶液可能會(huì)混濁，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時(shí)穩(wěn)定。
5、直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基。
6、在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時(shí)，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時(shí)后更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。
7、在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。
8、對(duì)于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進(jìn)一步減少了轉(zhuǎn)染時(shí)間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過293-H，293-F，COS-7L和CHO細(xì)胞的試驗(yàn)，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低。快捷的步驟和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫(kù)的篩選和蛋白瞬時(shí)表達(dá)。

二、適用細(xì)胞株范圍
不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株范圍各不相同。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室常常會(huì)用到不止一種細(xì)胞株，甚至是比較特殊的細(xì)胞株。一個(gè)轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株越多，當(dāng)然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen的資料，Lipofectamine 2000已經(jīng)證實(shí)可用于高達(dá)517種細(xì)胞株，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍。要看看Lipofectamine 2000是否適用于你現(xiàn)有的細(xì)胞株，可以訪問以下Invitrogen

三、適用的核酸類型和DNA大小    
有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 熒光標(biāo)記的Oligo, RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染，這使得Lipofectamine 2000適用范圍非常廣泛，無論是基因表達(dá)分析的DNA轉(zhuǎn)染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能勝任，不需要為不同目的購(gòu)買不同試劑了。但，zui常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個(gè)DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。

四、用量
Lipofectamine 2000用的劑量根據(jù)說明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染。

五、注意事項(xiàng)         
 Lipofectamine 2000要求細(xì)胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基，使得操作方便了許多，但是要注意制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。

復(fù)合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測(cè)所用的無血清培養(yǎng)基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外還應(yīng)該留意，如果研究的基因要求比較長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，比如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者時(shí)細(xì)胞表面蛋白，選擇細(xì)胞鋪板密較低的轉(zhuǎn)染試劑，不適合用 Lipofectamine 2000。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 

對(duì)于大多數(shù)陽離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽離子脂質(zhì)體試劑量以得到zui大的轉(zhuǎn)染效率。DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常推薦是1:2或者1:3，優(yōu)化可以從0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進(jìn)行大劑量的轉(zhuǎn)染，只要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細(xì)胞的數(shù)目、陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA量就可以了。

還有轉(zhuǎn)染的時(shí)候培養(yǎng)基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和鏈霉素，一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前就不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

陽離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4度保存，要注意避免多次反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間開蓋，因?yàn)榭赡軙?huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)然還有要注意質(zhì)粒的質(zhì)量，質(zhì)粒的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵。