細(xì)胞換液、傳代及凍存

用10％胎牛 DMEM培養(yǎng)液，37℃ 下置于5％CO₂培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80％，用0．25％胰酶消化傳代后接種(細(xì)胞密度5 XlO⁴)于培養(yǎng)瓶或孔板，待細(xì)胞融合至約70％后用于實驗。

細(xì)胞株培養(yǎng)方法如下： 

1.貼壁細(xì)胞換液：

1）吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。

2）用1xD-hank`s洗一次。

3）加入適量的新鮮培養(yǎng)液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.懸浮細(xì)胞換液

1)吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液放入15ml離心管中離心1500rpm 5min。

2)細(xì)胞沉淀用1xD-hank`s洗一次。

3)加入適量的新鮮培養(yǎng)液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.細(xì)胞傳代（貼壁細(xì)胞傳代采用胰酶消化法，常用消化液為0.25%的胰蛋白液）

1）吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。

2）用1xD-hank`s洗一次。

3）加入0.5ml-1ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）。

4）靜止2-10分鐘（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。

5）吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)基。

6）用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。

7）吸取1/5-1/10細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

8）加入適量的新鮮培養(yǎng)液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4.細(xì)胞凍存：

1）預(yù)先配制凍存液：90%胎牛血清+10%DMSO

2）取對數(shù)期生長細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后加入培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)，離心（1500rpm 5min）去上清留沉淀加適量凍存液，用吸管吸打制成細(xì)胞懸液（1 XlO⁵-5X10⁶/ml)

3）加入1ml細(xì)胞懸液于凍存管中，密封后標(biāo)記凍存細(xì)胞名稱和凍存日期。

5.細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出凍存管，迅速投入37度-38度水浴中

2）使其融化5min內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原液體的10倍以上，低速離心1500rpm 5min

3）去上清，加入培養(yǎng)液，細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)