在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。在細胞發生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發生早于細胞核的變化，而此時Propidium Iodide（PI）不能通過細胞膜。

細胞壞死時，雖然也會發生磷脂酰絲氨酸外翻，但此時細胞膜的通透性明顯增加，PI等核酸染料進入細胞與細胞核中的核酸結合，發出紅色熒光。所以Annexin V-FITC(綠色熒光)常與鑒定細胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，來區分凋亡細胞與死亡細胞。

技術原理及步驟

1. 離心收集細胞，微量離心機轉速1000 rpm，離心時間5 min，棄培養基。

2. 用冷PBS洗滌細胞兩次。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106 cells/mL。

4. 在細胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕輕混勻后于2~8°C避光條件下孵育15min。

5. 加入10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min。

6. 在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

應用實例

應用領域

細胞的早期凋亡及區分凋亡與壞死細胞

服務周期

我公司在正式接受實驗委托2個星期左右完成實驗并提供實驗報告。

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

需提供細胞類型，處理條件。

慧穎生物專業血清10年，我們不生產血清，我們只是高品質動物血清的搬運工

血清是一種成分復雜的混合物，不同批次血清對細胞生長的促進作用不同。大規模細胞培養中由血清引起的細胞生長狀態不佳及病毒滴度的影響表現在以下幾個方面：

1、細胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細胞瓶中分出兩瓶細胞，用同一種培養液，分別加入10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養72小時，會出現對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來大規模培養細胞。

2、細胞傳代后形態不正常，細胞狀態發生變化 ；由于血清的質量問題，使原本狀態正常的細胞經傳代后形態會變差；比如：細胞瓶里會出現一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細胞表面形成一層油狀覆蓋物；細胞的輪廓變得模糊，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴展生長。

3、細胞傳幾代后就出現脫壁現象，不能連續傳代 ；質量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細胞會從正常的貼壁狀態，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現象就是細胞表面不光滑，晃動細胞瓶會看到細胞表面有絮狀物隨培養液波動。隨著傳代次數增加，細胞萎縮的情況越來越嚴重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細胞長的很好，致密的單層，狀態也很正常，但是接毒后細胞基本不發生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業造成的損失是相當大的，不產毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力、物力，尤其是時間上的浪費，從培養細胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現不產毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費掉了，這也是牛血清給疫苗企業造成的風險之一。

5、細胞生長的狀態一般，產毒少，毒價低。這種情況比較常見，細胞是病毒的載體，由于血清質量不好，導致細胞生長狀態不好，病毒就無法進行正常的復制。并非所有病毒都不能復制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產品。

看來一款血清直接關系細胞的生死存亡，不用擔心，慧穎提供無支原體，低內毒素和低血紅素的，無反復凍融的高品質血清

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